课外阅《读：PCR技术的诞生》(素材)word教案 中图版生物选修1

6.3  PCR技术的诞生
 [PCR仪器]
　　pcr仪器的发展[]
　　pcr温度循环至关重要，pcr扩增仪各参数必须准确。自perkin –elmercetus公司第一台pcr扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一 步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。
　　为了便于了解和选购适宜的pcr实验设备，现将部分国内外pcr扩增仪列表如下；这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点。国产1109型dna扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b体积小，智能化与自动化程序高，可以兼做套式pcr，方便实用。以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数，可以达到节省劳动力的目的。在采用这些仪器作pcr试验之前，一般均应实测管内温度变化循环情况，以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度，用于修正设计的循环参数。温度滞后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形状（与铝块孔匹配程度）的影响，这对变温铝块式仪器影响更大些。对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器，在使用低于室温的温度来保冷pcr反应后小管时，应注意冷凝水的问题，勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。
　　国内外生产的几种dna扩增仪
　　1109型
　　北京新技术所与军科院联合
　　机械臂
　　变温水浴
　　电子调温
　　40×0.5ml
　　16400元/台[]
　　90a/b型
　　中科 院遗传所
　　机械臂
　　变温水浴
　　电热
　　14000元/台
　　ptc-51a/b型
　　军事医学科学院
　　变温气流
　　电子调兼作套式
　　30×0.5ml[]
　　12000元/台
　　dna thermal cycler
　　perkin –elmercetus(美)
　　变 温铝块
　　压缩机致冷
　　48×0.5ml
　　us $ 20000.-
　　thermocycler
　　＃60
　　＃00
　　＃180
　　b..braun
　　biotech
　　(德)
　　变温水浴98℃四档[]
　　电热,自来水冷却
　　60×1.5ml
　　100×1.5ml
　　180×1.5ml
　　dm 30000.-
　　automatic temperature cy-cler single block twin block
　　ericomp inc.(美)
　　变温铝块25～100℃
　　电热,自来水冷却
　　29×1.5ml
　　58×1.5ml
　　us $4985.-
　　us $7980.-
　　grant autogen
　　grant instrumant ltd(美)
　　变温水浴0～99℃
　　电热,自来水冷却或加冷循环器
　　50×1.5ml
　　or
　　50×1.5ml
　　us $250. –plus
　　us $ 15.-for
　　rack(x2)
　　techne phc-1[]
　　phc-2
　　techne ltd.(英)
　　变温铝块0～99℃三档
　　电热500w水冷100w
 　　54×0.5ml
　　54×0.5ml
　　24×1.5ml
　　￡3383. –
　　￡3997. -
　　biooven
　　biothrm corp(美)
　　变温气流
　　-150℃
　　115v 11a
　　200’s of 4×96plate
　　us $ 2990. -
　　trio-thermo-block tb-1
　　biomertra(德) 半导体变温[]
　　220v
　　3×20管
　　分别控温
　　dm12900. -
　　micro cycler e
　　eppendorf(美) 变温铝块
　　220v/100v
　　3×29管
　　us $ 3500. -
　　［PCR常见问题］
　　PCR产物的电泳检测时间
　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚 至消失。
　　假阴性，不出现扩增条带[来源:学。科。网]
　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。[

　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Ta q酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次 冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
　　Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
　　物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
　　靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
　　假阳性
　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
　　引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

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